Implementare rapidamente progetti di citometri a flusso utilizzando moduli di acquisizione dati ad alta precisione

La citometria a flusso è ampiamente utilizzata dal personale medico e diagnostico per analizzare le caratteristiche delle cellule. Una cellula alla volta, valutano otticamente i livelli di proteine, le condizioni di salute del sangue, la granularità e le dimensioni delle cellule e altri attributi. Sebbene siano sistemi altamente sensibili, i progettisti di citometri sono sotto la costante pressione di accelerare i tempi di analisi, richiedendo nuovi approcci sia alla citometria a flusso che all'elettronica associata.

I citometri sottopongono le singole cellule alla luce laser per creare segnali di diffusione e fluorescenza. Per catturare rapidamente e accuratamente la luce risultante e convertirla in segnali digitali è necessario un fotodiodo a valanga (APD) e un'elettronica complessa. La circuiteria per questo processo può richiedere molto tempo per la progettazione e l'implementazione, in particolare se si considera che i sistemi di acquisizione dati della citometria a flusso richiedono dispositivi ad alta velocità e a basso rumore per garantire la precisione del sistema.

Per supportare in modo economico l'analisi veloce della citometria a flusso, i progettisti possono risolvere i problemi di velocità e precisione con una soluzione di acquisizione dati che comprende driver amplificatori interni e un convertitore analogico/digitale (ADC).

Questo articolo mostrerà brevemente come funzionano i sistemi di citometria a flusso. Presenta poi ADAQ23878 di Analog Devices, un modulo ADC a 18 bit, e mostra come utilizzarlo per progettare uno stadio di rilevamento e conversione del citometro a flusso. Verrà anche presentato un kit di valutazione associato.

Principi moderni della citometria a flusso

La moderna citometria a flusso è un processo automatizzato che analizza le molecole cellulari e superficiali, caratterizza e definisce diversi tipi di cellule in una popolazione cellulare eterogenea. Senza contare il tempo di preparazione, che potrebbe essere oltre un'ora, lo strumento esegue una valutazione da tre a sei caratteristiche di 10.000 singole cellule in meno di un minuto.

Per farlo, è fondamentale la fase di preparazione delle singole cellule della citometria a flusso. L'organizzazione dei campioni avviene per via idrodinamica in un fluido che incanala le cellule o le particelle in un flusso di campioni stretto a cella singola per l'analisi. Con questa trasformazione, le singole cellule devono mantenere le loro caratteristiche biologiche naturali e i loro componenti biochimici.

La Figura 1 mostra lo schema di uno strumento citometro a flusso che inizia in alto con il campione di cellule multiple.

Figura 1: Schema di un citometro a flusso, dalla focalizzazione della guaina all'acquisizione dei dati. (Immagine per gentile concessione di Wikipedia, modificata da Bonnie Baker)

I sei componenti principali del citometro a flusso sono una cella a flusso, un laser, un fotodiodo a valanga (APD), un amplificatore in transimpedenza (TIA), un ADC e un computer per la raccolta e l'analisi dei dati.

Il citometro a flusso ha un flusso liquido o un fluido-guaina che si restringe per portare e allineare le cellule in una sola fila attraverso il fascio di luce. La luce laser cattura una cella alla volta, creando un segnale di luce diffusa in avanti (FSC) e un segnale di luce diffusa lateralmente (SSC). La luce di fluorescenza viene smistata con specchi e filtri e poi amplificata da un APD.

Il passo successivo è quello di rilevare, digitalizzare e analizzare l'uscita di luce risultante dopo che ha colpito l'APD. Per il rilevamento, l'amplificatore operazionale di ingresso FET LTC6268 di Analog Devices, da 500 MHz e a bassissima corrente di polarizzazione e basso rumore di tensione, è ideale per il TIA ad alta velocità necessario per il rilevamento.

Figura 2: Il circuito TIA utilizza un APD (PD₁) e un amplificatore operazionale FET a bassa corrente di ingresso per convertire le correnti ultrabasse del fotodiodo in una tensione di uscita a IN1+. (Immagine per gentile concessione di Bonnie Baker)

È essenziale progettare questo circuito amplificatore con la più ampia larghezza di banda possibile, quindi le capacità parassite devono essere ridotte al minimo. Ad esempio, la capacità di retroazione parassita, C, influenza la stabilità del circuito e la larghezza di banda della Figura 2. Indipendentemente dalla scelta del contenitore per il resistore, ci sarà sempre una capacità parassita nel percorso di retroazione dell'amplificatore. Tuttavia, un contenitore 0805, che ha una distanza maggiore tra i terminali e la più bassa capacità parassita, è preferibile per le applicazioni ad alta velocità.

Aumentare la distanza tra i terminali R₁ non è l'unico modo per diminuire la capacità. Un altro modo per ridurre la capacità da piastra a piastra è quello di schermare i percorsi del campo E che danno origine alla capacità parassita inserendo una traccia di terra in più sotto la resistenza R₁ (Figura 3).

Figura 3: L'aggiunta di una traccia di terra sotto il resistore di retroazione smista il campo E lontano dal lato di retroazione e lo scarica a terra. (Immagine per gentile concessione di Analog Devices)

In questo caso, il metodo comporta specificamente il posizionamento di una breve traccia di terra sotto e tra le piazzole del resistore vicino all'estremità di uscita del TIA. Questa tecnica genera un valore di capacità parassita di 0,028 pF con una larghezza di banda TIA di 1/(2π*R_F*C_PARASITIC), pari a 11,4 MHz.

I segnali di luce ottica puntano verso diversi diodi a valanga con filtri ottici appropriati. Il sistema APD, TIA e ADC converte questi segnali in una rappresentazione digitale corrispondente e invia i dati al microprocessore per l'ulteriore analisi.

Gli strumenti moderni hanno di solito più laser e APD. Gli attuali dispositivi commerciali hanno dieci laser e trenta fotodiodi a valanga. L'aumento del numero del laser e del rivelatore fotomoltiplicatore permette l'etichettatura multipla degli anticorpi per identificare con precisione le popolazioni bersaglio tramite marcatori fenotipici.

Tuttavia, la velocità di analisi dipende da un sottile equilibrio di:

• Velocità della guaina del fluido
• Capacità del processo di focalizzazione idrodinamica di formare linee di cellule singole
• Diametro del tunnel
• Capacità di preservare l'integrità di una cellula
• Elettronica

Focalizzazione acustica nella citometria a flusso

Mentre l'aggiunta di più laser e APD accelera l'analisi e l'identificazione, nel migliore dei casi, gli ultimi metodi moderni di citometria a flusso di singole cellule possono raccogliere dati su un milione di cellule al minuto. In molte applicazioni, come il rilevamento di cellule tumorali circolanti nel sangue a livelli bassi come 100 cellule per millilitro, questo non è adeguato. Nelle applicazioni cliniche sulle cellule rare, i test necessitano regolarmente dell'analisi di miliardi di cellule, che richiede molto tempo.

L'alternativa al processo di preparazione delle cellule con focalizzazione idrodinamica è un processo di focalizzazione acustica. Qui, un materiale piezoelettrico, come il titanato di zirconato di piombo (PZT), è fissato a un capillare di vetro per convertire gli impulsi elettrici in vibrazioni meccaniche (Figura 4a). Usando un PZT per far vibrare le pareti laterali di un capillare di vetro alla frequenza di risonanza della cella di flusso rettangolare, il sistema genera una varietà di onde acustiche stazionarie con un numero variabile di nodi pressori.

Figura 4: Illustrazione di una cella di flusso acustica realizzata con un capillare di vetro rettangolare (a). La posizione dei primi tre nodi pressori per un capillare a larghezza fissa (b). (Immagine per gentile concessione di National Center for Biotechnology Information)

Questi nodi di frequenza PZT allineano le particelle che scorrono in linee di flusso multiple e discrete (Figura 4b). La cella a flusso acustico utilizza un'onda acustica lineare e stazionaria per sintonizzarsi su varie lunghezze d'onda creando armoniche singole o multiple. Come previsto dal semplice modello di onde stazionarie lineari, le cellule del campione producono una o più linee di singole cellule all'interno della camera di flusso.

Con questa precisa organizzazione delle cellule, la larghezza del tunnel della guaina di flusso può allargarsi per un flusso più veloce oltre il raggio laser (Figura 5).

Figura 5: Con il flusso del campione idrodinamico (c. e d.), all'aumentare della larghezza della guaina, i campioni di cellule si disperdono, rendendo difficile il processo di misurazione ottica. Flussi di campioni focalizzati acusticamente (a. e b.) mantengono le cellule in una sola fila indipendentemente dalla larghezza della guaina. (Immagine per gentile concessione di Thermo Fischer Scientific)

La tradizionale focalizzazione idrodinamica (Figura 5c.) organizza le linee di singole cellule in preparazione per la scansione laser. Mentre un imbuto più ampio per il nucleo del flusso del campione assicura una maggiore velocità del materiale della guaina (Figura 5d.), questo si traduce anche nella diffusione dell'organizzazione delle singole cellule, compromettendo il segnale e la qualità dei dati.

La focalizzazione acustica (Figura 5a.) posiziona le cellule biologiche e altre particelle in stretto allineamento, anche con un tunnel più ampio. Questo preciso allineamento delle celle permette tassi di campionamento più elevati senza compromettere la qualità dei dati (Figura 5b.).

In pratica, la focalizzazione acustica della citometria a flusso aumenta la frequenza di campionamento delle cellule di 20 volte circa (Figura 6).

Figura 6: Confronto del tempo di campionamento per varie apparecchiature di citometria a flusso basate sulla citometria a flusso fluido (A, B, C) rispetto alla citometria a focalizzazione acustica (D). (Immagine per gentile concessione di Thermo Fischer Scientific)

Nella Figura 6, le apparecchiature di A, B e C utilizzano la tecnologia idrodinamica, mentre D utilizza l'approccio di flusso della citometria a focalizzazione acustica.

Acquisizione dei dati di citometria a flusso con focalizzazione acustica

La progettazione dell'elettronica per l'apparecchiatura di citometria a flusso a focalizzazione acustica richiede un'elettronica di fotorilevamento ad alta velocità per adattarsi alla velocità delle cellule ematiche e del fluido della guaina attraverso l'ugello di diametro maggiore. LTC6268 ad alta velocità da 600 MHz menzionato in precedenza, in combinazione con una configurazione specializzata del contenitore 0805, porta la velocità di rilevamento ottico fino a 11,4 MHz (Figura 7, a sinistra). L'uscita di LTC6268 è alimentata a un ADC ADAQ23878 di Analog Devices per la digitalizzazione.

Figura 7: L'ADC ADAQ23878 digitalizza il segnale ottico dal fotodiodo (PD₁) e dal circuito TIA (sinistra). (Immagine per gentile concessione di Bonnie Baker)

ADAQ23878 è una soluzione di acquisizione System-in-Package (SiP) dati a 18 bit, 15 Msps, di precisione, ad alta velocità. Riduce enormemente il ciclo di sviluppo dei sistemi di misurazione di precisione trasferendo l'onere progettuale della selezione, dell'ottimizzazione e del layout dei componenti del driver di ingresso dal progettista al dispositivo.

L'approccio modulare del SiP riduce il numero di componenti del sistema finale combinando più blocchi comuni di elaborazione e condizionamento del segnale in un singolo dispositivo, insieme all'ADC ad alta velocità a 18 bit e 15 Msps con registro ad approssimazioni successive (SAR). Questi blocchi includono un amplificatore driver ADC a basso rumore e completamente differenziale e un buffer di riferimento stabile.

ADAQ23878 incorpora anche i componenti passivi critici che utilizzano la tecnologia iPassive di Analog Devices per ridurre al minimo le fonti di errore dipendenti dalla temperatura e ottimizzare le prestazioni. Lo stadio di pilotaggio a regolazione rapida dell'ADC contribuisce alla sua capacità di garantire una rapida acquisizione dei dati.

Valutazione del micromodulo ADAQ23878

Per valutare ADAQ23878, Analog Devices fornisce la scheda di valutazione EVAL-ADAQ23878FMCZ (Figura 8). La scheda dimostra le prestazioni del micromodulo ADAQ23878 ed è uno strumento versatile per valutare un progetto di front-end per citometria a flusso e una varietà di altre applicazioni.

Figura 8: La scheda di valutazione EVAL-ADAQ23878FMCZ per ADAQ23878 ha circuiti di alimentazione integrati, viene fornita con il software per il controllo e l'analisi dei dati, ed è compatibile con SDP-H1. (Immagine per gentile concessione di Analog Devices)

La scheda di valutazione EVAL-ADAQ23878FMCZ richiede un PC con Windows 10 o superiore, una sorgente di segnale di precisione a basso rumore e un filtro passa-banda adatto ai test a 18 bit. La scheda di valutazione richiede il plug-in ADAQ23878 ACE e il driver SPD-H1.

Conclusione

L'esame di una cellula biologica alla volta usando tecniche standard di citometria a flusso idrodinamico ha avuto successo, ma con la necessità di analisi più veloci, si è visto crescere l'interesse per tecniche basate su metodi di flusso a focalizzazione acustica. Tuttavia, anche l'elettronica che supporta la citometria a flusso più avanzata deve migliorare, riducendo al minimo lo spazio, i costi e i tempi di sviluppo.

Come mostrato, l'amplificatore operazionale ad alta velocità LTC6268 e la soluzione di acquisizione dati in micromodulo ADAQ233878 di precisione e ad alta velocità possono essere combinati per creare il sistema di acquisizione dati completo per le apparecchiature di citometria a flusso avanzato.